脳グループの研究における標本観察で役立つBZシリーズ

世界に先駆けて遺伝治療薬を開発。難治性疾患の治療に向けた先進的取り組み

遺伝子治療の実用化に向けて世界に先駆けた研究を行っている、大阪大学大学院医学系研究科の教授、森下竜一氏。日本で初めて「臨床」の名称を冠した遺伝子治療の研究室を2003年に立ち上げ、基礎研究から創薬、臨床治療に至るトランスレーショナルリサーチを展開している。2008年3月には創薬ベンチャーを通じて、末梢性血管疾患の治療を目的とした遺伝子治療薬の承認申請を厚生労働省に行うなど、顕著な業績をあげている。現在、生活習慣病や免疫疾患、がん、遺伝病など、難治性疾患の治療に向けた研究が本格化している。

01. 世界初となるHGFによる遺伝子治療薬を承認申請

正常な遺伝子を体内に導入することによって病気の治療をめざす遺伝子治療は、1990年に米国において世界で初めて実施されたのを皮切りに、これまで多数の臨床試験が積み重ねられてきた。日本では米国の5年後から臨床試験が始まっている。

当初は先天性疾患の治療を主なターゲットとしたが、近年は感染症やがんなどの後天性疾患を対象とするようになり、さらには生活習慣病の治療への応用にまで広がりを見せている。

現在、有望な遺伝子治療の一つとして脚光を浴びているのが、血管新生の領域。そして、この分野で世界に先駆けた研究を進めているのが大阪大学大学院医学系研究科の教授、森下竜一氏だ。日本初の臨床遺伝子治療の研究室を立ち上げ、基礎研究から臨床応用に向けた、いわゆるトランスレーショナルリサーチ^※を展開している。

大阪大学は、1999年に金田安史教授のもとで日本初の遺伝子治療学講座を開設し、基礎研究において多くの研究成果をあげてきた。森下氏の臨床遺伝子治療講座はこれらの成果を臨床段階で活かすことで、病気で苦しむ患者に役立つ医療の実現をめざしている。

現在、実用化に大きく近づいているのが、閉塞性動脈硬化症などの末梢性血管疾患を治療するための、HGF^※（hepatocyte growth factor＝肝細胞増殖因子）を用いた遺伝子治療臨床研究だ。

末梢性血管疾患とは、四肢の末梢血管が閉塞することで筋肉などが虚血状態に陥り、しびれや疼痛を引き起こすほか、下肢潰瘍となることもある病気。患者数は日本だけで約10万人、米国では約100万人にも上るとされている。

これに対して森下氏の研究室では、細胞や臓器の再生作用があるHGFを虚血局所に注入することで、血管の新生と虚血状態の改善を図る臨床研究を実施。優れた成果をあげたことから、東証マザーズ上場の医薬系ベンチャー企業、アンジェスＭＧ株式会社を通じて、2008年3月にHGF遺伝子治療薬の承認申請を厚生労働省に行った。審査をパスすれば先進国で初の遺伝子治療薬となる。

02. 臨床研究が進むおとり型核酸医薬による薬物ステント

血管の病気に関連して、森下氏がHGFとは別に取り組んでいるのが、おとり型核酸医薬（デコイ）による臨床研究だ。閉塞性動脈硬化症や狭心症、心筋梗塞には、狭くなった血管を風船のついたカテーテル（細長い管）で広げ、場合によっては金属ステント（編み目状の筒）を入れる治療法が広く用いられている。しかし、風船で血管を広げても、再び血管が狭くなる再狭窄という問題が起こるケースがある。

これを解消するために開発中なのが、デコイを用いた風船療法後の再狭窄予防だ。これは薬物ステントといわれ、バルーンカテーテルの先に核酸医薬デコイオリゴが塗布してあり、狭窄した患部に導入することで、再狭窄を引き起こす種々の遺伝子の活性化を抑えると期待されている。

すでに動物実験では優れた効果が出ている。この治療法が実現すれば、再狭窄によって生じる患者の肉体的、経済的な負担が大幅に軽減できることになる。

03. 血管新生から神経の機能再生へと広がる研究テーマ

すでに臨床段階を迎えている二つの研究に加えて、森下氏の研究室では次世代の血管新生治療に向けた挑戦を行っている。いずれも遺伝子治療の新たな可能性を秘めた研究だ。

その一つが抗菌ペプチド^※という血管内皮増殖因子を末梢動脈疾患への分子治療に用いる研究である。分子スクリーニングの結果、血管新生作用を有する「AG-30」というペプチドを同定することに成功。これには血管新生の効果とともに、大腸菌や黄色ブドウ球菌などに対する抗菌作用があるとされ、血管新生に向けて、より安全で確実な治療法として期待されている。

また、HGFによる治療についても時代の先を見すえた研究が始まっている。従来の血管新生という効果に加えて、神経の機能再生という画期的なテーマである。HGFは神経細胞の突起を伸ばす作用があることが分かっていて、病気によって損なわれた神経回路の再構築、ひいては記憶力の改善に役立つのではないか、と考えられている。具体的にはアルツハイマー型認知症の治療に向けた研究が始まっている。

「血管の動脈硬化など主に従来の生活習慣病に着目した治療法の研究を続けてきましたが、アルツハイマー型認知症も実は生活習慣病の一つとしてとらえ、血管の病と見直すことで治療に向けた新たな可能性が見えてきました。私の研究室では今までになかった治療法の研究に挑んでいます」

下肢などの末梢性血管から心臓、そして脳へと、適用用途で広がりを見せるHGFによる治療。それによって、従来よりもメリットのある代替治療への道が拓かれようとしている。

04. 創薬のために大学研究におけるイノベーションを追求

遺伝子治療における数々の先進的な取り組みを通じて、研究成果の実用化をめざす森下氏。時代をリードする研究者として、基礎研究から臨床研究に至るあり方そのものを変革していこう、という志を胸に秘めている。特に強調するのは新たな時代における大学の使命だ。

「医療技術をみると、従来のアプローチからの進歩はそろそろ限界に近づいています。創薬のあり方を含めてイノベーションが必要なのです。しかし、製薬メーカーは従来の創薬の仕組みに適応しすぎていて、既成概念から脱するのに苦しんでいるように思います。一方、大学側は基礎研究面で良いものを生み出しているにも関わらず、創薬としての芽を伸ばしきれず、実用化になかなかこぎ着けられないのが現状です。こうした現状を打開するには、大学の役割がますます重要になっていて、より戦略的な研究を行っていく必要があります」

大学における研究を変えていくため、森下氏は研究手法や組織体制など「新しい枠組みをつくっていく必要がある」と語る。そして、研究員の意識変革も必要という。研究の現場で重視しているのが研究のスピード感だ。「何か新しいことを成し遂げるには、それを証明する価値を世界のどこよりも早く生み出していく必要があり、私たちの研究は時間との戦い」と森下氏。そのため、研究室の中では「時間＝経済的価値」という意識が徹底している。

また、研究員の育成という点でも、森下氏は時代の変化への対応を説いている。

「大学は先端技術を教える場であったのですが、日進月歩の時代にあっては先端といってもせいぜい半年程度のリードでしかありません。どんな技術でもすぐに陳腐化する現在、技術だけを教えればよいという時代ではありません」

そこで森下氏が指導に力を注いでいるのがプロジェクトマネジメントの能力だ。研究における目標の設定からゴールに向けた取り組み方までを、研究室の大学院生に熱心に説いている。「研究成果を出して外部の評価を得てこそ、研究者は次にステップアップできるわけです。競争的資金を得るという観点からも、正しい目標設定の方法と目標にたどり着くまでの手段を教えるように努めています」

05. 先端研究を進めるためには周辺領域の技術向上も不可欠

研究のスピード化、効率化を図るためには、研究手法や組織体制ととともに実験に用いる機器も重要。森下氏の研究室では、研究スピードをアップさせる機器については、費用対効果を踏まえつつ、設備投資を積極的に進めている。

遺伝子治療の研究で難しいのは、体内に取り込まれた遺伝子がどのような働きをするのか、というメカニズムの解明。動物実験ではわかったとしても、実際に人体でどう作用するのかをトレースするのは困難がともなう。「遺伝子治療の研究を進めていくには遺伝子に関する基礎研究にとどまらず、細胞の働きを観察、分析する技術など広く周辺領域の技術を高めることが必要。また、臨床にしても薬の製造から診断、トレースまですべてにおいてイノベーションが求められています」と森下氏は強調する。

「これからの医療を考えた時、まずデバイスと薬の融合が重要なテー マです。それとともに高分子医薬品が重要になっていきます。こうした潮流を先取りするには従来の研究手法は通用しないのではないか、と考えます。特に臨床に持ち込むハードルは高いものがあります。例えば、核酸医薬の薬剤ステントにしても、これからの医療を担う一つといえますが、デコイオリゴが血管内部のどこまで入り込むのか、といった観察が重要です。できればin vivo（人体内）でしかもリアルタイムに観察する技術が求められています」

06. 脳グループの研究における標本観察で役立つBZシリーズ

森下氏の研究室では、蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡は生体内に投与した遺伝子をトレースする上で重要な観察機器。各種製品を用途に応じて使い分けている。

その中で、2008年2月の導入以来、研究員の間で利用頻度が高いのが、キーエンスのオールインワン蛍光顕微鏡BZシリーズだ。マウスの末梢血管から心臓、脳と、幅広い領域の細胞を観察する上で威力を発揮している。

「研究を手がけた当初から蛍光顕微鏡はBZシリーズだけを利用しています」と語るのが、臨床遺伝子治療学の脳グループに所属する武田朱公氏。森下教授の研究成果を踏まえて、アルツハイマー型認知症の治療や予防の方法を研究している。この病気は神経細胞が死滅していくものだが、武田氏は「実は血管との関連が深く、高血圧などの危険因子が分かっています。私たちはこうした因子をもとに介入の道を探っています」という。

BZシリーズの主な用途は、実験マウスの脳の血管を観察すること。アルツハイマーモデルマウスの脳の血管を抽出して、拡大観察するほか、写真撮影および計測を行っている。「蛍光でも明視野でも観察できる上、操作方法がわかりやすい点が便利」とのこと。一個体から数十個の標本を観察するが、写真撮影までを一時間程度でこなしている。

武田氏の研究によると、脳の血管内で酸化ストレスが亢進すると、血液の循環が悪くなる。その状態を観察する上でBZシリーズが役に立っているという。血管は組織切片よりも厚みがあるため、拡大観察では焦点を合わせるが難しい。その点、クイックフルフォーカスの機能により、複数焦点の画像をもとに全焦点画像として観察することができる。また、蛍光観察でありがちな蛍光ボケについてはヘイズリダクション機能によって簡単に除去できるという。

武田氏の実験では脳の全体を観察することも多い。そのため、低倍率で全体を見渡すとともに、計測機能を活用している。

「アルツハイマーの病理所見である老人斑は分布にムラがあるため、一画面で脳の全体を見られるメリットは大きいですね。また、老人斑の数や面積を計測する上でも役に立っています。現在、作成している論文に用いる写真もBZシリーズで撮影しています」

武田氏によると、同じ研究分野で過去の論文を見ていくと、血管はピントが合いにくいせいか、一部分しか鮮明に写っていない写真も多いという。これに対して、BZシリーズで撮影したものは太い血管も細い血管もはっきりと写すことができるそうだ。

実際、武田氏が撮影した写真は米国の学会で評判となった。アルツハイマー型認知症の研究で世界的な権威とされる研究者がクリアな写真に関心を持ち、「撮影のプロトコールをぜひ送ってほしい」と依頼したほどだという。今や実験写真の品質が論文の質を左右しかねない時代なのだ。

厚み・歪み・うねりのある標本でもピントが合う

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07. 血管の新生状況を観察する上で威力を発揮

一方、森下研究室の心・血管グループに所属する真田文博氏は、HGFと老化の関係を研究している。血管新生には骨髄細胞から分化した血管内皮前駆細胞（EPC）が関わっているとされるが、アンジオテンシン２というホルモンが働くことによって、EPCが老化して機能しなくなることを発見。これに対して、HGFは老化を抑制することをマウスの実験で立証した研究者だ。

真田氏は、グリーンマウスやトランスジェニックマウスを用いて、骨髄細胞から分化したEPCが血管になっていく様子を撮影するのにBZシリーズを利用している。「脚の筋肉を低倍率で観察し、HGFの投与によって血管がどの程度、新生しているかを調べるのに役立っている」とのこと。従来、共焦点顕微鏡を使用していたそうだが、BZシリーズを使い出してから「標本の観察から写真撮影までのスピードが倍の早さになり、作業の効率が大幅にアップしました」と語る。

ソフトウエアで一番活用しているのは、ヘイズリダクション機能。「細胞は蛍光の当たるポイントによって鮮明さが異なるため、蛍光ボケを除くために必須の機能です。共焦点顕微鏡を使っていた時はピントをいちいち合わせるのに苦労していましたが、BZシリーズを使い出してからは楽になりました」

生きた細胞の観察では、できる限りコンタミなしの状態を維持することが欠かせない。その点、「BZシリーズは暗室が不要な上、コンパクトなので、研究室内に設置して標本を作製してすぐに観察できて便利です」と真田氏はメリットを述べている。

また、共焦点顕微鏡では細胞をクリアな状態で観察するために油浸が必要となるが、倍率を変えた際、逆に標本が油でゆがんで見えてしまうといった問題がある。「BZシリーズでは油浸がほとんど不要なので、これも大きなメリット」と真田氏は指摘している。

なお、真田氏はEPCに関する研究とともに、ペリオスチンという骨の再生に関係するたんぱく質が血管に及ぼす影響についても研究している。この中では、がんの増殖抑制について実験を行っていて、がんの浸潤エリアを計測する上でBZシリーズの計測機能が役立っているという。

森下氏の研究室では、武田氏の脳グループや真田氏の心・血管のグループのほかにも、分子治療や腎・動脈硬化・核酸医薬、骨・アンチエイジング、核酸医薬といった研究があり、遺伝子治療の実現に向けた研究を産学共同で積極的に行っている。森下氏は、遺伝子治療を体系的にとらえ、幅広い視点から研究を展開することで、医療の現場における貢献をいち早く進めていく考えだ。

そして、「研究を通じて一日も早く患者さんの役に立つ成果を出したい」という森下氏の理念は研究室内に徹底している。どのグループでも「新しいと思ったことは素早くとりかかる」という意識のもとで、研究のスピードアップ、効率化に向けた取り組みに余念がない。

BZシリーズはこうした研究員の間で重宝されていて、使用頻度が高いだけでなく、画期的な発見に欠かせない機器となっている。拡大観察におけるスピード化、効率化を通じて、遺伝子治療における最先端の研究をサポートしているのである。

（2008年10月現在）

暗室不要・多機能・コンパクト、だから使いやすい

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＜豆知識＞　遺伝子治療

遺伝子の異常によって発症する先天的な病気などに対して、正常な遺伝子を体内に送り込むことで細胞の修復を図っていく治療。従来、ベクターウイルスを用いた研究が行われてきたが、より安全なプラスミドによる体内への導入が検討されている。近年は生活習慣病など後天的な病気への適応も盛んに研究されている。