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顕微鏡を知る

蛍光観察を行うために

蛍光観察に必要な装置

 生命科学の研究が進む中で、生きた状態の細胞やたんぱく質を観察する技術が進化してきました。蛍光観察はその重要な役割を果たしています。
 蛍光観察は、標識となる蛍光色素や蛍光たんぱく質を用いて、観察したい部分を強調して写し出す技術です。物質の分子に特定の光(励起光)を当てると光エネルギーを吸収して、その中の電子が励起状態となります。その後、元の基底状態に戻る過程で蛍光と呼ばれる光を放つ現象を応用しています。

 蛍光観察を行うためには、光源をはじめ、特定の光を透過させる蛍光フィルター、そして蛍光観察に適した対物レンズなどが必要です。
 特により良い蛍光画像を得るためには、適切な蛍光フィルターを選ぶことが欠かせません。蛍光フィルターには光源から特定の波長域の光を通す「励起フィルター」と、試料から発せられた蛍光の中から観察に必要なものを透過させる「吸収フィルター」があります。(ほかに、特定の波長の光を反射し、それ以外を透過させることで励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラーが必要です。)
 最近では、蛍光試薬の特性に応じた蛍光フィルターのセット(蛍光フィルターキューブ)がメーカーから発売されているため、観察対象から組み合わせを選ぶことができます。

蛍光フィルターの選択のポイント

 蛍光フィルターのセット(蛍光フィルターキューブ)を選ぶ際、蛍光色素の特性とセットの励起フィルター、蛍光フィルターの波長帯をできるだけ一致させる必要があります。それぞれのフィルターの特性は次の通りです。

・励起フィルターの場合

 光の波長域の幅の広さへの対応に応じて、広帯域、狭帯域のフィルターがあります。原則として、帯域の広い方が明るい画像が得られますが、生体試料へのダメージを抑えるため、狭帯域のフィルターを用いる場合が一般的です。

・蛍光フィルターの場合

 主にロングパスフィルター(LP)とショートパスフィルター(SP)、バンドパスフィルター(BP)に分かれます。LPは一定の波長よりも長い波長のみを通します。逆に、SPは一定の波長よりも短い波長のみを通します。また、BPは一定の波長域のみの光を通します。
 用いる蛍光試薬が一つの場合は、LPを用いることでより明るい像を得ることができます。一方、複数の蛍光色素を用いる場合はBPを使い分けることでそれぞれの蛍光画像を得ることができます。

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